七类消*剂对非洲猪瘟病*荧光定量PCR检测结果的影响
南文龙1，巩明霞1，陆游1，2，李林1，王清华1，吴晓东1，陈义平1
（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛；
2.扬州大学兽医学院，江苏扬州）
摘要：为评价戊二醛、酚、含碘类等常用消*剂消*后对非洲猪瘟病*荧光定量PCR检测结果的影响，基于畜禽栏舍、运载工具、器具消*及皮肤黏膜消*目的，按消*剂说明书推荐选择不同工作浓度，分别与不同滴度的非洲猪瘟病*培养物于20℃条件下作用30min后，采用荧光定量PCR方法检测作用后产物。结果显示，与对应的阳性对照组相比，含氯类（二氯异氰尿酸钠）、过硫酸氢钾类、二氧化氯类消*剂，消*后对荧光定量PCR检测结果影响最显著，检测Ct值显著上升或检测不到；戊二醛类、含碘类（主要成分聚维酮碘）消*剂，核酸降解能力相对较弱，检测Ct值稍有上升；酚类、季铵盐类、含碘类（主要成分碘、磷酸、硫酸）类消*剂，检测Ct值基本无变化。本研究评价了7类常用消*剂消*对非洲猪瘟病*荧光定量PCR检测结果的影响，可为防控实践中科学、客观评价分析消*效果提供技术参考。
关键词：非洲猪瘟；消*剂；荧光定量PCR；消*效果
中图分类号：S.61文献标识码：A文章编号：-X（）03--06DOI：10./j.issn.-X..03.
由于消*剂灭活病*机制不同，本研究拟采用荧光定量PCR方法检测戊二醛、酚、含氯等7类9种常用消*剂与ASFV培养物作用后的产物，评估对检测结果的影响，以期为ASF防控实践中科学、客观评价分析消*效果提供技术参考。1材料与方法1.1消*剂收集市面常见的戊二醛、酚、含碘、季铵盐、含氯、过硫酸氢钾、二氧化氯等7类消*剂，包括戊二醛类2种、酚类1种，含碘类2种、季铵盐1种、含氯类1种、过硫酸氢钾类1种、二氧化氯类1种。消*剂产品详细信息见表1，所有产品均注册有兽药产品批准文号，试验时均在有效期内。1.2病*ASFV中国分离株：CN2/1，由国家非洲猪瘟参考实验室分离鉴定并保存。1.3试剂与耗材DMEM培养基、胎牛血清，购自GIBCO公司；细胞瓶及96孔细胞板，购自Corning公司；病*RNA/DNA提取试剂盒，购自天根公司；荧光定量PCR扩增试剂Luna通用探针法qPCR预混液，购自NEB公司。1.4猪肺泡巨噬细胞、红细胞和血清制备无菌采集健康猪肺脏，向肺脏注入灭菌PBS灌洗数次，收集灌洗液；离心收集猪肺泡巨噬细胞，按5×个/mL、μL/孔接种96孔板；铺板次日进行测试。同步无菌采集抗凝血，离心收集血清；之后将细胞沉淀洗涤3~5次，弃去白细胞和血小板，用PBS配成10%猪红细胞悬液，4℃保存备用。1.5病*滴度测定采用含1%猪血清的PBS10倍连续稀释ASFV培养物至10-8，以每孔μL接种96孔板上的猪肺泡巨噬细胞培养物，同时加入1%猪红细胞10μL，每个稀释度做4个重复孔。将96孔板置于37℃5%CO2条件下培养6d，每天观察，记录并统计各稀释度培养孔中红细胞吸附（HAD）反应结果，采用Reed-Muench法计算半数红细胞吸附量（HAD50）。1.6消*剂与ASFV作用采用PBS10倍连续稀释经病*滴度测定后的ASFV培养物，取~倍稀释液备用。参考农业农村部文件《关于在非洲猪瘟防控中做好消*剂选择工作的通知》，以有效灭活ASFV为目的，基于畜禽栏舍、运载工具、器具消*及皮肤黏膜（部分含碘类消*剂适用）等不同消*场景，按消*剂说明书标明浓度范围合理选择工作浓度，并将消*剂原液制成10倍工作浓度备用。将0.1mL消*剂10倍工作浓度液和0.1mL不同稀释度病*液分别加入到0.8mLPBS中充分混合，20℃条件下作用30min，作用后产物直接用于后续测试。无法制成10倍工作浓度液的含碘类消*剂C1，按照1:2工作浓度，将0.5mL消*剂原液和0.1mL不同稀释度病*液，分别加入到0.4mLPBS中充分混合，按相同条件作用处理，作用后产物直接用于后续测试。阳性对照组，直接将0.1mL不同稀释度病*液加入0.9mLPBS中充分混合；阴性对照组，直接取1mLPBS。阴、阳性对照均按相同条件作用处理，作用后产物直接用于后续测试。1..7病*DNA提取取μL上述作用后产物，按病*RNA/DNA提取试剂盒说明，于Thermo自动核酸提取仪上提取病*核酸，将提取的核酸保存于-80℃冰箱备用。1..8荧光定量PCR扩增采用OIE《陆生动物诊断实验和疫苗手册》（版）第2.8.2章节中，King等[1]基于VP72蛋白建立的ASFV荧光定量PCR方法检测。上、下游引物和探针由上海生工生物技术有限公司合成。PCR反应体系为：2×qPCR预混液10μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.8μL，探针（10μmol/L）0.4μL，模板DNA2μL，最后用灭菌水补齐至20μL。反应条件为：50℃孵育2min；95℃预变性3min；95℃预变性15s，58℃退火延伸1min（采集FAM荧光信号），共40个循环。1.9检测结果分析按1.6—1.8步骤，重复处理各组样品3次并检测，统计平均Ct值，计算批间变异系数；取同一批次提取核酸重复检测3次，统计平均Ct值，计算批内变异系数。统计各组检测平均Ct值，将各组检测结果分别与对应阳性对照组比较，采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。2结果2.1病*滴度测定经测定，ASFV培养物病*滴度为.2HAD50/mL。采用PBS10倍连续稀释后，本试验中与消*剂作用的ASFV滴度为.2~.2HAD50/mL。2.2各消*剂检测结果消*剂在选定稀释度下与不同滴度ASFV作用后，采用荧光定量PCR检测，结果详见表2。重复处理样品检测3次，各组平均Ct值批间变异系数为0.3%~6.7%；取同一批次样品提取病*核酸重复检测3次，各组平均Ct值批内变异系数为0.1%~2.3%。结果（表2）显示，本研究中不同滴度ASFV与戊二醛类消*剂作用后，荧光定量PCR检测Ct值均显著上升。与阳性对照组相比，戊二醛类A1产品1
0~1:稀释下，当病*滴度为.2~.2HAD50/mL时，检测Ct值上升约3.19~4.15；当病*滴度为.2HAD/mL时，未检测到Ct值。A2产品在1
0~1:稀释灭活不同滴度病*后，检测Ct值上升1.21~4.33。酚类B产品与不同滴度病*作用后检测发现，与对应阳性对照组测定Ct值基本相当，仅个别检测结果出现Ct值波动（如1:工作浓度下灭活.2HAD/mL病*时），总体看酚类B产品灭活病*后对荧光定量PCR检测结果影响不大。含碘类C1产品，当灭活病*滴度为.2~.2HAD50/mL时，检测Ct值变化不显著；当灭活病*滴度为.2~.2HAD/mL时，检测Ct值显著上升3.45~5.76。C2产品与不同滴度病*作用后检测发现，当灭活病*滴度为.2~.2HAD/mL时，比对应阳性对照组测定Ct值稍有上升（0.46~1.06）；仅灭活病*滴度为.2HAD/mL时，2.00%稀释度下检测结果Ct值明显上升（约2.46）。季铵盐类D产品与不同滴度病*作用后检测发现，与对应阳性对照组测定Ct值基本相当，基本无显著差异。含氯类E产品与不同滴度病*作用后检测，均未检测到Ct值。过硫酸氢钾类F产品，当灭活病*滴度为.2HAD/mL时，检测Ct值上升约1.68；当灭活病*浓度为.2~.2HAD/mL时，均未检测到Ct值。二氧化氯类G产品，当灭活病*滴度为.2~.2HAD/mL时，检测Ct值上升5.17~7.52；当灭活病*滴度为.2~.2HAD/mL时，均未检测到Ct值。3讨论ASFV属于囊膜DNA病*，对环境抵抗力强，但对戊二醛、含氯、含碘类等多数常用种类消*剂敏感[2]。现场消*后，常需对消*效果进行监测评价，以防止由于消*不彻底造成ASFV传播扩散。目前，采用病*分离方法只能在农业农村部指定实验室中开展，且技术难度大、检测周期长，而检测抗原的ELISA或胶体金等免疫学检测方法敏感性达不到消*效果评价要求。分子生物学方法特别是荧光定量PCR方法，具有简便、快速、高通量等优势，是实践中ASFV病原检测最主要手段，且适用于唾液、血液、组织、环境拭子等多种样品类型，可广泛应用于养殖场、屠宰场、无害化处理厂、运输车辆等多种场景消*效果评估。结果显示，与其他几种消*剂相比，含氯类（二氯异氰尿酸钠）、过硫酸氢钾类、二氧化氯类3类消*剂，消*后对荧光定量PCR检测结果影响最显著，检测Ct值明显上升或未检测到，且其影响能力排序为：含氯类（二氯异氰尿酸钠）＞过硫酸氢钾类＞二氧化氯类。含氯类消*剂（二氯异氰脲酸钠）遇水后可释放出次氯酸，可导致病原蛋白质变性、改变膜通透性并可直接影响DNA合成等来杀灭病原[3]。本研究中含氧类消*剂与滴度≤.2HAD/mL病*作用后检测，均未见Ct值。当前市售过硫酸氢钾类消*剂，多由过硫酸氢钾、表面活性剂、无机盐与有机酸等组成，其消*原理：一是利用过硫酸氢根的强氧化能力，在水溶液中产生羟基自由基等改变微生物细胞膜的通透性使之破裂；二是使用时过氧离子能将氯离子氧化为次氯酸，达到杀灭病原目的[4]。本研究中过硫酸氢钾类消*剂与滴度为.2HAD/mL病*作用后检测时Ct值上升，与≤.2HAD/mL病*作用后检测未见Ct值。二氧化氯类消*剂是一类强氧化剂，并兼具含氯类消*剂作用机制，可与细胞内部酶发生氧化反应，还可氧化分解氨基酸、核酸等，使微生物蛋白质的合成被抑制并导致蛋白质功能丧失[5]。本研究中当二氧化氯类消*剂与滴度.2~.2HAD/mL病*作用后检测Ct值上升，与≤.2HAD/mL病*作用后检测均未见Ct值，可推断其核酸降解能力弱于前两者。戊二醛类消*剂，主要通过凝固病原微生物蛋白质中的氨基、羧基，破坏病原微生物蛋白分子使其死亡[6]，在本研究中戊二醛类消*剂显示较弱的核酸降解能力。A1产品仅当与滴度≤.2HAD50/mL病*作用后检测未见Ct值。A1、A2相比，当灭活病*滴度为.2HAD/mL时，A2仍可检测到Ct值而A1未检测到，表明A1对检测Ct值影响大于A2，推测可能与A1具有更高戊二醛工作浓度有关。含碘类消*剂消*时，游离状态的碘原子产生强氧化作用，主要破坏病原体的细胞膜结构及蛋白质分子，并可部分作用于核酸。本研究中显示含碘类消*剂具有较弱的核酸降解能力，C1仅当与滴度为.2~.2HAD/mL病*作用后，检测Ct值出现上升。本研究中的酚类和季铵盐类消*剂，消*后与对应阳性对照组测定Ct值基本相当。酚类属于原生质*物，可穿透破坏细胞膜、沉淀蛋白质[2]；季铵化合物是一种膜活性剂，可损伤、破坏细胞膜，导致细胞质电位和pH梯度变化[2]，两者在消*原理上对核酸作用小。采用荧光定量PCR检测评估对ASFV的消*效果时，未检测到Ct值的原因：一方面是消*剂本身即具有核酸降解能力，另一方面是消*前后进行的清洁、清洗也会清除ASFV核酸。由于荧光PCR方法原理是对病*核酸检测，现场检测时若结果阳性，仅表示存在ASFV核酸，并不能说明病*本身是否存活，是否达到有效灭活效果还应根据现场条件以及使用消*剂种类、使用浓度、作用时间等因素综合分析。此外，也可考虑采用指示微生物方式进行辅助的消*效果验证。综上所述，本研究评估了7类常用消*剂灭活ASFV后，对荧光定量PCR检测结果的影响，可为ASFV消*效果评价提供技术参考。
参考文献（略）
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